双荧光素酶施行的旨趣是期骗荧光素酶与底物聚会发生化学发光响应的特色，把感酷好的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶讲明质粒。然后转染细胞，合乎刺激或惩办后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的上下判断刺激前后或不同刺激对感酷好的调控元件的影响。同期，为了减少内在的变化成分对施行准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（rinilla luciferase)的质粒手脚对照质粒与讲明基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试着力不受施行要求变化的烦躁。

发光旨趣

双萤光素酶施行的具体圭臬

1、讲明基因质粒的构建。将遐想片断插入到荧光素酶抒发的讲明基因载体上，如pGL3-basic。

2、转染细胞。将讲明基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，凭据需要对细胞进行惩办。共转染时，由于内参具有很强的入手子，因此讲明基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

Luciferase活性测定：⑴ 首次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II熔化在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，不详断绝LAR II的响应。⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，奏乐混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。⑸ 数据惩办。领先计较出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单元1，即可赢得不同惩办组的相对luciferase活性，也即是该惩办组基因转录的调控活性。

着力解读

文件一：PMID: 28697764；IF=41.444

（1）措施

（2）着力

考据linc00673和miR-150-5p的聚会情况。野生型linc00673可与miR-150-5p聚会，但突变型linc00673却不可。通过构建荧光素酶讲明载体，将荧光素酶与linc00673基因一语气，然后转染到细胞内检测荧光活性。着力标明，miR-150-5p mimics显赫裁减了野生型linc00673的荧光素酶活性，但对突变型linc00673荧光素酶活性莫得影响。以上着力标明，linc00673可与miR-150-5p聚会。

文件二：PMID: 35963157；IF=5.741

（1）措施

（2）着力：

考据YAF2和miR-217-5p的聚会情况。野生型YAF2可与miR-217-5p聚会，但突变型YAF2却不可。通过构建荧光素酶讲明载体，将荧光素酶与YAF2基因一语气，然后转染到细胞内进行检测。着力标明，miR-217-5p mimics显赫裁减了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2荧光素酶活性莫得影响。以上着力标明，YAF2可与miR-217-5p聚会。

文件三：PMID: 35212607；IF=6.832

（1）措施

（2）着力

本操办考据了PEG10和miR-449a以及RPS2与miR-449a的聚会情况。这里以PEG10和miR-449a为例。野生型PEG10可与miR-449a聚会，但突变型PEG10却不可。通过构建荧光素酶讲明载体，将荧光素酶与PEG10基因一语气，然后转染到细胞内进行检测。着力标明，miR-449a mimics显赫裁减了野生型PEG10的荧光素酶活性，但对突变型PEG10荧光素酶活性莫得影响。诠释PEG10与miR-449a靶向聚会。

文件四：PMID: 35110549；IF=9.685

（1）措施

（2）着力

考据PAARH和HOTTIP分袂与六种miRNA的聚会。以上着力显现，miRNA转染组的荧光活性显赫裁减，标明miRNA与PAARH和HOTTIP之间存在靶向聚会。

谛视该操办中莫得突变型的着力，这么的例子很少，一般荧光素酶的着力是需要包括突变型和野生型的，我方遐想施行的本事谛视一下。

所用耗材：

NEST酶标板

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